1. Pengertian Detektor HPLC
Tinggi Kromatografi cair berperforma (atau kromatografi cair tekanan tinggi, HPLC) merupakan bentuk kromatografi kolom sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan memanjang
HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic bahan kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s) melalui kolom, dan detektor yang menunjukkan ingatan waktu Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung pada interaksi antara keadilan tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang digunakan.
Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern.
2. Klasifikasi Detektor
Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
a. Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector).
Detektor dapat dibedakan menjadi :
• Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
• Detektor konduktivitas
• Detektor tetapan dielektrika
b. Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute property detector).
Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,
• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.
Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.
• Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..
2) Memerlukan pemisahan fase ferak terlebih dahulu
Termasuk didalamnya FID dan ECD.
Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu:
1. Detektor spektrofotometrik
Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal, sehingga dibutuhkan suatu kompromi. Dibandingkan dengan ribuan dollar yang harus dikeluarkan untuk spektrofotometer yang hanya bahkan tergolong kelas dua saja, maka $2500 atau sekitar itu akan mendapatkan sebuah detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada 254 atau 280 nm (harga-harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinyu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri.
Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi, tetapi detektor-detektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak kasus. Contohnya, protein yang menyerap semua pada 280 nm akibat adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir semua senyawa aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin, pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada 254 nm.
Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat terlarut dan panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita dan panjang jalan yang melewati sel detektor, tetapi sebagai pedoman kasar, detektor ultraviolet akan dapat “melihat” kuantitas nanogram, bisa kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor indeks bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap temperatur.
2. Detektor Fluorometrik
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).
3. Detektor Elektrokimia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik.
Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya melewati semacam jembatan garam.
4. Desain detector
Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa mikroliter.
5. Pemilihan detektor
Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut :
a. cukup sensitive
b. stabilitas dan keterulangan tinggi
c. respon linear terhadap solute
d. waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir
e. relibilitas tinggi dan mudah digunakan
f. tidak merusak cuplikan.
Dari berbagai macam detector yang ada detektor indeks bias merupakan satu-satunya detektor pada HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv dan sangat peka tehadap perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan panjang gelombang yang variabel merupakan pilihan yang paling baik bagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangat spesifik dapat digunakan detektor-detektor fluorometer dan elektrokimia.
6. Analisis Kuantitatif
Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut, konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas
sinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram.
Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan membuat kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition.
Tinggi Kromatografi cair berperforma (atau kromatografi cair tekanan tinggi, HPLC) merupakan bentuk kromatografi kolom sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan memanjang
HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic bahan kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s) melalui kolom, dan detektor yang menunjukkan ingatan waktu Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung pada interaksi antara keadilan tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang digunakan.
Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern.
2. Klasifikasi Detektor
Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
a. Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector).
Detektor dapat dibedakan menjadi :
• Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
• Detektor konduktivitas
• Detektor tetapan dielektrika
b. Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute property detector).
Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,
• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.
Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.
• Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..
2) Memerlukan pemisahan fase ferak terlebih dahulu
Termasuk didalamnya FID dan ECD.
Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu:
1. Detektor spektrofotometrik
Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal, sehingga dibutuhkan suatu kompromi. Dibandingkan dengan ribuan dollar yang harus dikeluarkan untuk spektrofotometer yang hanya bahkan tergolong kelas dua saja, maka $2500 atau sekitar itu akan mendapatkan sebuah detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada 254 atau 280 nm (harga-harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinyu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri.
Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi, tetapi detektor-detektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak kasus. Contohnya, protein yang menyerap semua pada 280 nm akibat adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir semua senyawa aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin, pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada 254 nm.
Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat terlarut dan panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita dan panjang jalan yang melewati sel detektor, tetapi sebagai pedoman kasar, detektor ultraviolet akan dapat “melihat” kuantitas nanogram, bisa kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor indeks bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap temperatur.
2. Detektor Fluorometrik
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).
3. Detektor Elektrokimia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik.
Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya melewati semacam jembatan garam.
4. Desain detector
Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa mikroliter.
5. Pemilihan detektor
Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut :
a. cukup sensitive
b. stabilitas dan keterulangan tinggi
c. respon linear terhadap solute
d. waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir
e. relibilitas tinggi dan mudah digunakan
f. tidak merusak cuplikan.
Dari berbagai macam detector yang ada detektor indeks bias merupakan satu-satunya detektor pada HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv dan sangat peka tehadap perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan panjang gelombang yang variabel merupakan pilihan yang paling baik bagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangat spesifik dapat digunakan detektor-detektor fluorometer dan elektrokimia.
6. Analisis Kuantitatif
Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut, konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas
sinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram.
Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan membuat kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition.
