DETEKTOR HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

1. Pengertian Detektor HPLC

Tinggi Kromatografi cair berperforma (atau kromatografi cair tekanan tinggi, HPLC) merupakan bentuk kromatografi kolom sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan memanjang

HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic bahan kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s) melalui kolom, dan detektor yang menunjukkan ingatan waktu Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung pada interaksi antara keadilan tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang digunakan.
Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern.

2. Klasifikasi Detektor

Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
a. Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector).
Detektor dapat dibedakan menjadi :
• Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
• Detektor konduktivitas
• Detektor tetapan dielektrika
b. Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute property detector).
Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,
• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.
Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.
• Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..
2) Memerlukan pemisahan fase ferak terlebih dahulu
Termasuk didalamnya FID dan ECD.


Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu:
1. Detektor spektrofotometrik
Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal, sehingga dibutuhkan suatu kompromi. Dibandingkan dengan ribuan dollar yang harus dikeluarkan untuk spektrofotometer yang hanya bahkan tergolong kelas dua saja, maka $2500 atau sekitar itu akan mendapatkan sebuah detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada 254 atau 280 nm (harga-harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinyu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri.
Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi, tetapi detektor-detektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak kasus. Contohnya, protein yang menyerap semua pada 280 nm akibat adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir semua senyawa aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin, pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada 254 nm.
Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat terlarut dan panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita dan panjang jalan yang melewati sel detektor, tetapi sebagai pedoman kasar, detektor ultraviolet akan dapat “melihat” kuantitas nanogram, bisa kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor indeks bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap temperatur.


2. Detektor Fluorometrik
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).

3. Detektor Elektrokimia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik.
Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya melewati semacam jembatan garam.

4. Desain detector
Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa mikroliter.


5. Pemilihan detektor
Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut :
a. cukup sensitive
b. stabilitas dan keterulangan tinggi
c. respon linear terhadap solute
d. waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir
e. relibilitas tinggi dan mudah digunakan
f. tidak merusak cuplikan.
Dari berbagai macam detector yang ada detektor indeks bias merupakan satu-satunya detektor pada HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv dan sangat peka tehadap perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan panjang gelombang yang variabel merupakan pilihan yang paling baik bagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangat spesifik dapat digunakan detektor-detektor fluorometer dan elektrokimia.

6. Analisis Kuantitatif
Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut, konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas
sinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram.
Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan membuat kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition.

Kelebihan dan kekurangan HPLC dibandingkan Kromatografi Gas

Kelebihan dari teknik HPLC dibandingkan dengan GC ( Gas Chromatography) :
1. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
2. HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi
3. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi
4. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya
5. Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam beberapa cm
sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)
6. Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno, sehingga dapat menurunkan biaya
karyawan.
7. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Beberapa kegunaan dari HPLC :
1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapis zat berpori.
4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

Pengantar

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

FASE NORMAL HPLC

Secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. meskipun disebut sebagai “normal”, ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari hplc.
kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

FASE BALIK HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der waals. senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

fase balik hplc adalah bentuk yang biasa digunakan dalam hplc.


Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
• tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
• kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
• komposisi yang tepat dari pelarut
• temperatur pada kolom
itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor
ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar uv dari beberapa panjang gelombang. jika anda menyinarkan sinar uv pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.
Detektor dan Batas Deteksi

Detektor untuk sebuah HPLC adalah komponen yang mengemisikan sebuah respon akibat senyawa sampel yang terelusi dan selajutnya memberi sinyal sebuah puncak pada kromatogram. Detektor ini terletak tepat dibelakang fase stasioner untuk mendeteksi senyawa-senyawa pada saat terelusi dari kolom. Luas-bidang dan tinggi puncak biasanya bisa disesuaikan dengan menggunakan kontrol tuning yang kasar dan halus, dan parameter deteksi dan kesensitifan juga bisa dikontrol (pada kebanyakan kasus). Ada banyak tipe detektor yang bisa digunakan dengan HPLC. Beberapa detektor yang umum antara lain: Indeks Refraksi (RI), Utlra-Violet (UV), Fluorescent, Radiokimia, Elektrokimia, Mendekati-Infra Merah (Near-MS), Spektroskopi Massa (MS), NMR, dan Penghamburan Cahaya (LS).

Sumber: http://www.chem-is-try.org/?sect=belajar&ext=analisis05_03